commit 5b906ba75c21e73779460fd5e046627e0d6975c8 Author: coolneng Date: Sat Jun 26 18:05:40 2021 +0200 Initial commit diff --git a/.gitignore b/.gitignore new file mode 100644 index 0000000..d8dfacf --- /dev/null +++ b/.gitignore @@ -0,0 +1 @@ +bibliography diff --git a/data/1_seq_10000_reads/HVR.fastq b/data/1_seq_10000_reads/HVR.fastq new file mode 100644 index 0000000..e2b0909 --- /dev/null +++ b/data/1_seq_10000_reads/HVR.fastq @@ -0,0 +1,40000 @@ +@1 +TGCGCCAGCAGCTTGGTCGGCCAGGGGGCCTCCTACAATGAGCAGTTCTTC ++1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@1 +TGCGCCAGCAGCTTGGTCGGCCAGGGGGCCTCCTACAATGAGCAGTTCTTC ++1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@1 +TGCGCCAGCAGCTTGGTCGGCCAGGGGGCCTCCTACAATGAGCAGTTCTTC ++1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@1 +TGCGCCAGCAGCTTGGTCGGCCAGGGGGCCTCCTACAATGAGCAGTTCTTC ++1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@1 +TGCGCCAGCAGCTTGGTCGGCCAGGGGGCCTCCTACAATGAGCAGTTCTTC ++1 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+TAGCACGGTGAGCCGTGTCCCTGGGCCCGAAGCAACTGCTCATGCGGAACCGATAAACTGCTGGCACAGAAGTACAGAGAGGTCTGGCGTGCGGGCTGGGCGACTGCCAGGATTAGGGGGAATTCCCTTTCTTTTCGAGAGACTTTGTCCACTTCAGAACATTCCCTTATAGTCACCTCAACATTCATTAATATAGATCTGCCTATAGCCCCGCACCTGGGTCTTGTCGATACCGGCACATATACTCATGTTCATATTCTGAAACAAGTCACTGCTTAACTTTTCCATCACTGTGATGATGGTATCTGTGGGTTGCGGGCATGCGGCTTC ++199 TRBV27 TRBJ2-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;555555555555555555 +@200 TRBV28 TRBJ2-1 _17_28_2 +TAGCACGGTGACCGTGCCCTGCCCGAAAACTGCTCTTGTATGGAGGGCCCACATAAACTGCGGCACAGAGGTACAATAGATGTCGGTGTGGTGCGGCGGACTCCAGAATCAGGGAGCAACCTCACTTCTTCTCTCTAGAGACACTGTCCCCTCGGAATATCTCCTTTTTCTTTCTTGTCAACATCTTGAAAATTAGATCAGCCCGTATGCCCCAACCGGGTCTTGGTCGATCCAAGCAACATTTTTCTGGTGCCATTCCGGACACTTCCAGATAAAACTTTCTCCCCGCCATTTTGACTAGATATCTCGAGCTCGGCGTTATTGTCATATC ++200 TRBV28 TRBJ2-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;55555555555555555 +@1 TRBV2 TRBJ2-3 _1_0_0 +GAGCACTGTCAGCACGGGTGCCTGGGCCAAAATACTGCGTATCTGTGCGGCCCCTCGCTTCACTGCTGGCACAGAAGTACATGGCTGAGTCCTCCAGCTTTGTGGACCGGATCTTCAGAGTGAAATTTGATCCATCAGGCCTTTCAACTGAGAATTGATCATCGAATATTTCAGACTTCTCTGAGATTTCATTATTATAAAAGGAAACCAGAAACTCGACTTTCTGCCCCAAGATTTGTCTGTACCAATAGAAGTATAAGTGATTAGAGATGGGGACACAGCGCAAGATCACTTCCTGTCCCATCTGTGTGACCTGATGGCTGGGAGTCTGGGTGACTTCAGGTTC ++1 TRBV2 TRBJ2-3 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;5 +@2 TRBV7-2 TRBJ2-1 _1_0_3 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+TAGCACGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAAGAACTGCTCATTGGTACCTAGTGACGCTTCACTGCTGGCACAGAAGTACATGGCTGAGTCCTCCAGCTTTGTGGACCGGATCTTCAGAGTGAAATTTGATCCATCAGGCCTTTCAACTGAGAATTGATCATCGAATATTTCAGACTTCTCTGAGATTTCATTATTATAAAAGGAAACCAGAAACTCGACTTTCTGCCCCAAGATTTGTCTGTACCAATAGAAGTATAAGTGATTAGAGATGGGGACACAGCGCAAGATCACTTCCTGTCCCATCTGTGTGACCTGATGGCTGGGAGTCTGGGTGACTTCAGGTTC ++183 TRBV2 TRBJ2-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@184 TRBV5-6 TRBJ2-7 +TGTGACCGTGAGCCTGGTGCCCGGCCCGAAGTACTGCTCGTAGGCCTTGCCCCCTGTCCCCACCGAGCTGCTGGCACAGAGATAGAGGGCCGAGTCCCCCAGCAACAAGGCGTTCACATTCAGCTCAGAGCTATAGTTAGGGAACTGGTGACCTGAGAATCGATCAGGGAAGTTGCCTCTCTGTCTCTCTTCCTCCTCATAATACTGAAAGATAAACTGGGGCCCCTGACCCAGGGCCTGTTGGTACCAGGACACAGTGTCATGCCCAGACTTAGGAGAGCATCTCAGAGTCACTTGCTGTCCTCTCGTTTTGATCAGGTGTGTGGGACTTTGGGTGACTCCAGCGTC ++184 TRBV5-6 TRBJ2-7 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@185 TRBV10-3 TRBJ1-1 +TACAACTGTGAGTCTGGTGCCTTGTCCAAAGAAAGCTTCAGTGTTCAAACCCGCTAGTCCCGACTCACTGATGGCACAGAAGTACACAGATGTCTGGGAGCTGGTAGCGGACTCCAGAGTGAGGAGGAAATCCTCTGTCTTTGATCTAGAGACACTATAGCCATCTGAGACTTCTCCTTTGTCAGTATCTTTAACACCATATGAGTAATGGATCAGCCTCAGCCCATGCCCCGGGTCTTGTCGATACCAGTACATATAGCGGTGGTTCTCAGTCTGGTGACATCTCAGAGTCACTGGTGTTCCTGTCTCTGTGACCTTGTGTCTTGGGCTCTGGGTGATTCCAGCATC ++185 TRBV10-3 TRBJ1-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@186 TRBV4-1 TRBJ2-1 +TAGCACGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAAGAACTGCTCATACTGGTCCGCTTGGCTGCTGGCGCAGAGATACAGGGCTGAGTCTTCTGGCTGCAGGGCGTGTAGGTGAAGGTTTAAGAGAGAGCTGTTGGGGCATTCAGGTGAGAAGCGACTTGGCACACTTTCATTTATAGAGAGTTTCTCATAGCTGTAGACAAACATGAGCTCCGGTGGCTTCTTAGCTTTCTGCTTGTACCAATACATAGCCCTGTGCCCCATATGTTGTTCACATTTCAAAGACTTCTTATTTGTCATTCCCATGACCAGGTGTTTTGGTGTCTGGGTAACTTCAGTGTC ++186 TRBV4-1 TRBJ2-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@187 TRBV4-1 TRBJ1-1 +TACAACTGTGAGTCTGGTGCCTTGTCCAAAGAAAGCTTCAGTGTCCCCGTCGCCCCCTGTCTCCCGATCTTGGCTGCTGGCGCAGAGATACAGGGCTGAGTCTTCTGGCTGCAGGGCGTGTAGGTGAAGGTTTAAGAGAGAGCTGTTGGGGCATTCAGGTGAGAAGCGACTTGGCACACTTTCATTTATAGAGAGTTTCTCATAGCTGTAGACAAACATGAGCTCCGGTGGCTTCTTAGCTTTCTGCTTGTACCAATACATAGCCCTGTGCCCCATATGTTGTTCACATTTCAAAGACTTCTTATTTGTCATTCCCATGACCAGGTGTTTTGGTGTCTGGGTAACTTCAGTGTC ++187 TRBV4-1 TRBJ1-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@188 TRBV15 TRBJ1-2 +TACAACGGTTAACCTGGTCCCCGAACCGAAGGTGTAGCCATAGCCCCCCTGTCCCCCCCCATCTCTGCTGGTGGCACACAGGTACATGGCTGTGTCCCCCAGGCCTGGTGAGCGGATGTCAAGAAAGCAGAAAGAAGTGTTCGGCCTCCTGGATTGGAAGTTATCAGGGGTGTCTGCTTCATTGTTAAAATCTTTGTCATAGTAGTGGAACAGCAGCTTTGGGGCCTGACTTGACTTCTGCTGGTACCAGTACATGACGTTATGGTTCAAAGTCTGAGAACAACTCAGGGTCACTGGCTTTCCAAACTGGGTAACCTGGTATCTTGGGTTCTGGATGACCATGGCATC ++188 TRBV15 TRBJ1-2 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@189 TRBV7-9 TRBJ1-1 +TACAACTGTGAGTCTGGTGCCTTGTCCAAAGAAAGCTTCAGCCCCCCCGGCTAAGCTGCTGGCACAGAGATACATGGCCGAGTCCCCCTGCTCTGTGCGCTGGATCTCCAAGGTGGAGAAAGATCCCTTAGGCCTCTCTGCAGAGAACCGATCACTGAGCAGCCTTGATTTTTCTAGTTGAGCTTCATTCTGGAAGTAAGTCAGAAACTCTGGGCCCTGCCCCAGGGTCTGTCGGTACCAATAAAGGCGGTTGTGTTCAGAAATTGGATCACACCTGAAAGTTACATTCTGTCCCCTCTTTGTGATCTTGTGTCTGGGGTTCTGGGAGACTCCAGTATC ++189 TRBV7-9 TRBJ1-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@190 TRBV5-6 TRBJ2-6 +AGCACGGTCAGCCTGCTGCCGGCCCCGAAAGTCAGGACGTTGGCCCCGGGTCCCTCGGGGTACCAAGCTGCTGGCACAGAGATAGAGGGCCGAGTCCCCCAGCAACAAGGCGTTCACATTCAGCTCAGAGCTATAGTTAGGGAACTGGTGACCTGAGAATCGATCAGGGAAGTTGCCTCTCTGTCTCTCTTCCTCCTCATAATACTGAAAGATAAACTGGGGCCCCTGACCCAGGGCCTGTTGGTACCAGGACACAGTGTCATGCCCAGACTTAGGAGAGCATCTCAGAGTCACTTGCTGTCCTCTCGTTTTGATCAGGTGTGTGGGACTTTGGGTGACTCCAGCGTC ++190 TRBV5-6 TRBJ2-6 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@191 TRBV5-1 TRBJ2-7 +TGTGACCGTGAGCCTGGTGCCCGGCCCGAAGTACTGCTCCCCCCTGTCCCGTAGTCCTCTTAAGCTGCTGGCGCAAAGATAAAGGGCCGAGTCCCCCAGCTCCAAGGTGCTCACATTCATCTCAGAGCGAGAGTTAGAGAACTGGCGCCCTGAGAATCGACCAGGGAAGTTTCCTTTGTTTCTCTGTGTCTCACTGAAGTATTCAAAGAGGAACTGAAGGCCCTGTCCTGGGGTCTGTTGGTACCAGGATACACTCCTATGCCCAGAGATAGGGGAGCAGCTCAGTGTCACTTGCTGTCCTCTCGTTTTGATCAGATATCTTGGAGTTTGAGTGACTCCAGCCTT ++191 TRBV5-1 TRBJ2-7 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@192 TRBV7-9 TRBJ2-7 +TGTGACCGTGAGCCTGGTGCCCGGCCCGAAGTACTGCTCGTTCCTGCTGGCACAGAGATACATGGCCGAGTCCCCCTGCTCTGTGCGCTGGATCTCCAAGGTGGAGAAAGATCCCTTAGGCCTCTCTGCAGAGAACCGATCACTGAGCAGCCTTGATTTTTCTAGTTGAGCTTCATTCTGGAAGTAAGTCAGAAACTCTGGGCCCTGCCCCAGGGTCTGTCGGTACCAATAAAGGCGGTTGTGTTCAGAAATTGGATCACACCTGAAAGTTACATTCTGTCCCCTCTTTGTGATCTTGTGTCTGGGGTTCTGGGAGACTCCAGTATC ++192 TRBV7-9 TRBJ2-7 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@193 TRBV7-7 TRBJ2-7 +TGTGACCGTGAGCCTGGTGCCCGGCCCGAAGTACTGCTCGTTCCCCCCCGCTAGTCCCAATAAGCTGCTGGCACAGCGATACATGGCTGAGTCCCGCTGCTCTGTGCGCTGAATCGTCAGAGTGGAGATGGATCCCTCAGGCCTCTCTGCAGAGAACCGATCACTGGGCAGCCCTGATTTGTCTGGTTGAGCTTCATAATTGAAGTAAGTCAGAAACTCTGGGCCCTGCCCCAGGGCCTGTTGATACCAATAAAGGGTTGCATGACTCGAAATTGGATCACACCTGAGAGTTACATCCTGTCCCCTCTTTGTGACTTTGTACCTGGGAGACTGGGAGACTCCAGCACC ++193 TRBV7-7 TRBJ2-7 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@194 TRBV4-2 TRBJ2-3 +GAGCACTGTCAGCCGGGTGCCTGGGCCAAAATACTGCGTATGGTCTATTTCTTGGCTGCTGGCACAGAGATACAGGGCCGAGTCTTCTGGCTGCAGGGTGTGTAGGTGAAGGAATAAGTGAGAGCTGTTGGGGCATTCAGGTGAGAAGCGACTTGGCACACTGTTGTTTTCAGTCTGTTCTTTAAAGTTGTAGACAAACATGAGCTCCAGTGGCTTCTTAGCACTTTGCTTGTACCAATACATAGCGTTATGCCCCAGATGTTGTTCACATTTCAAAGACTTCTTATTTGTCATTCCCATGACCAGGTGTCTTGGTGTCTGCGTAACTCCCGTTTC ++194 TRBV4-2 TRBJ2-3 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@195 TRBV14 TRBJ2-7 +TGTGACCGTGAGCCTGGTGCCCGGCCCGAAGTACTGCTCGTAGCTCCCCTTCCCTGTCCCCCTTTCTTGGCTGCTGGCACAGAAATAAACTCCAGAATCCTCCAGTTCTGCAGGCTGCACCTTCAGAGTAGAATACGTCCCTCCAGTCCTTTCAGCTAAGAATCGATTGTTGGGCATACCGGACTCATCCTGTTTAGACTCTTTCACAAAATGTAACAGAAATTTTATTTCTTTTCCCATAACACGTCGATACCAATAAAGATTATCATGTCCAGAAATTGGGTCACATCTCAGAGTCACAGTCTGGCCCTTCTCTATTACGCTGTGGCTGGGGAACTGAGTAACTCCAGCTTC ++195 TRBV14 TRBJ2-7 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@196 TRBV30 TRBJ1-1 +TACAACTGTGAGTCTGGTGCCTTGTCCAAAGAAAGCTTCAGTGGGCCCCCTGTCTCGGAAATCTACACTCCAGGCACAGAGATAGAAGCCAGAGTCACTGAGAAGGAGCTTCTTAGAACTCAGGATGAACTGCCGGTCCTGGGGTCTGGAGGCTGAGAGATTCTGGGGCACCTCAGAGCTGATCTGGCCAATACCAACGGAGTAGAAGAGCAGCTGGAGGCCCCTGCCTGCAGCCTGTCGGTACCAGTATAGGTTGGGGTTTGATGTTCCCTCCACAGTGCACTCCAGAGAGAGCGGGCTGCCCACAGGCTGCACCAGGGTCGCTGGCCATTGATGAATAGTCTGAGA ++196 TRBV30 TRBJ1-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@197 TRBV4-1 TRBJ2-1 +TAGCACGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAAGAACTGCTCATTGTCCCCCCCCGCTAGTCCCCCTTGGCTGCTGGCGCAGAGATACAGGGCTGAGTCTTCTGGCTGCAGGGCGTGTAGGTGAAGGTTTAAGAGAGAGCTGTTGGGGCATTCAGGTGAGAAGCGACTTGGCACACTTTCATTTATAGAGAGTTTCTCATAGCTGTAGACAAACATGAGCTCCGGTGGCTTCTTAGCTTTCTGCTTGTACCAATACATAGCCCTGTGCCCCATATGTTGTTCACATTTCAAAGACTTCTTATTTGTCATTCCCATGACCAGGTGTTTTGGTGTCTGGGTAACTTCAGTGTC ++197 TRBV4-1 TRBJ2-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@198 TRBV19 TRBJ2-1 +TAGCACGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAAGAACTGCTCATAGGGGCCCCCTGTCCCCTCTATACTACTGGCACAGAGATAGAAAGCTGTCGGGTTCTTTTGGGCCGATGTCACAGTGAGAGGAAAGGATTCCTTCTTCTCCCGAGAGACGCTGTACCCTTCAGCTATATCTCCTTTCTGAAAGTCATTTACTATCTGTGAGTAGTAGATCAATCTCAGCCCTTGCCCTGGGTCCTGTCGGTACCAGTACATGGCATCGTGGTTCAAATTCTGTTCACAACTCAGGGTCACATTCTGTCCTTCCTTTCTGAACAGGTACTTTGGGGACTGAGTGATTCCACCATC ++198 TRBV19 TRBJ2-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@199 TRBV27 TRBJ2-1 +TAGCACGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAAGAACTGCTCATTGGGAACCGATAAACTGCTGGCACAGAAGTACAGAGAGGTCTGGTTGGGGCTGGGCGACTCCAGGATCAGGGGGAAATTCCTCTTCTCTTTTCGAGAGACTTTGTACCCTTCAGGAACATCTCCCTTATCAGTCACCTCAACATTCATTGAATAGTAGATCTGCCTTAAGCCCAGCCCTGGGTCTTGTCGATACCAGGACATATACTCATGGTTCATATTCTGAGAACAAGTCACTGTTAACTTCTTTCCAGTCACTGTGATGAGGTATCTTGGGTTCTGGGTCACTTGGGCTTC ++199 TRBV27 TRBJ2-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; +@200 TRBV28 TRBJ2-1 +TAGCACGGTGAGCCGTGTCCCTGGCCCGAAGAACTGCTCATTGTAGGAGGGCCCACATAAACTGCTGGCACAGAGGTACATAGATGTCTGGTTGGTGCTGGCGGACTCCAGAATCAGGGAGAAGCGCTCCTTCTTCTCTCTAGAGACACTGTACCCCTCAGGAATATCTCCTTTTTCTTTCATTTTAACATCATATGAGAAATAGATCAGCCGTAGCCCCAGACCTGGGTCTTGTCGATACCAGAACATATTTTCATGGTCCATATCCTGGACACATTCCAGAAAAACTTTCTCTCCCGTCCTTTTGACTAGATATCTCGAGCTCTGGGTTACTTTCACATC ++200 TRBV28 TRBJ2-1 +;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;; diff --git a/data/in_silico_repertoire.html b/data/in_silico_repertoire.html new file mode 100644 index 0000000..ac6e5aa --- /dev/null +++ b/data/in_silico_repertoire.html @@ -0,0 +1,1402 @@ + + + + + + + + + + + + + + + +Generating in silico TCR repertoires + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + +
+
+
+
+
+ +
+ + + + + + + + + +
+
+ What's new? +
+
+
    +
  • Ran sequencing simulator with new error rates from the literature (lower than the first test): still have a lot of out-of-frame HVRs :(
  • +
  • Compared V and J alignment score and identity distributions among sample 111L and the two simulated repertoires. +
+ +
+
+
######### LOAD PACKAGES ##########
+library(immuneSIM)
+library(DT)
+library(Biostrings)
+library(ggplot2)
+library(ggpubr)
+library(patchwork)
+library(Biostrings)
+library(msa)
+library(dplyr)
+library(webr)
+library(plyr)
+library(ggtree)
+library(stringr)
+library(bsselectR)
+library(WeightedCluster)
+library(apcluster)
+library(reshape2)
+
+

1 Simulating TCR repertoires

+
+

immuneSIM R package

+ +

immuneSIM enables in silico generation of single and paired chain human and mouse B- and T-cell repertoires with user-defined tunable properties to provide the user with experimental-like (or aberrant) data to benchmark their repertoire analysis methods.

+
+Figure 1. Package functionality overview. +

Figure 1. Package functionality overview.

+
+
+

Methods overview

+
+Figure 2. immuneSIM flowchart. +

Figure 2. immuneSIM flowchart.

+
+
+
+

Parameters

+
    +
  • number_of_seqs: Integer defining the number of sequences that should be simulated
  • +
  • vdj_list: List containing germline genes and their frequencies
  • +
  • species: String defining species for which repertoire should be simulated ("mm": mouse, "hs": human. Default: "mm").
  • +
  • receptor: String defining receptor type ("ig" or "tr". Default: "ig")
  • +
  • chain: String defining chain (for ig: "h","k","l", for tr: "b" or "a". Default: "h")
  • +
  • insertions_and_deletion_lengths: Data.frame containing np1, np2 sequences as well as deletion lengths. (Pooled from murine repertoire data, Greiff,2017) Note: This is a subset of 500000 observations of the dataframe used in the paper. The full dataframe which can be introduced here can be found on: (Git-Link)
  • +
  • user_defined_alpha: Numeric. Scaling parameter used for the simulation of powerlaw distribution (recommended range 2-5. Default: 2, https://en.wikipedia.org/wiki/Power_law)
  • +
  • name_repertoire: String defining chosen repertoire name recorded in the name_repertoire column of the output for identification.
  • +
  • length_distribution_rand: Vector containing lengths of immune receptor sequences based on immune repertoire data (Greiff, 2017).
  • +
  • random: Boolean. If TRUE repertoire will consist of fully random sequences, independent of germline genes.
  • +
  • shm.mode: String defining mode of somatic hypermutation simulation based on AbSim (options: 'none', 'data','poisson', 'naive', 'motif', 'wrc'. Default: 'none'). See AbSim documentation.
  • +
  • shm.prob: Numeric defining probability of a SHM (somatic hypermutation) occurring at each position.
  • +
  • vdj_noise: Numeric between 0,1, setting noise level to be introduced in provided V,D,J germline frequencies. 0 denotes no noise. (Default: 0)
  • +
  • vdj_dropout: Named vector containing entries V,D,J setting the number of germline genes to be dropped out. (Default: c("V"=0,"D"=0,"J"=0))
  • +
  • ins_del_dropout: String determining whether insertions and deletions should occur. Options: "", "no_insertions", "no_insertions_n1", "no_insertions_n2", "no_deletions_v", "no_deletions_d_5", "no_deletions_d_3", "no_deletions_j", "no_deletions_vd", "no_deletions". Default: "")
  • +
  • equal_cc: Boolean that if set TRUE will override user_defined_alpha and generate a clone count distribution that is equal for all sequences. Default: FALSE.
  • +
  • freq_update_time: Numeric determining whether simulated VDJ frequencies agree with input after set amount of sequences to correct for VDJ bias. Default: Update after 50 percent of sequences.
  • +
  • max_cdr3_length: Numeric defining maximal length of cdr3. (Default: 100)
  • +
  • min_cdr3_length: Numeric defining minimal length of cdr3. (Default: 6)
  • +
  • verbose: Boolean toggling printing of progress on and off (Default: FALSE)
  • +
  • airr_compliant: Boolean determining whether output repertoire should be named in an AIRR compliant manner (Default: TRUE). (http://docs.airr-community.org/en/latest/)
  • +
+
+
+
+

Results

+

Following the quickstart guide, we can easily generate a TCRβ repertoire with 1000 different sequences:

+
# sim_repertoire <- immuneSIM(
+#         number_of_seqs = 1000,
+#         species = "hs", 
+#         receptor = "tr",
+#         chain = "b",
+#         verbose= TRUE)
+# 
+# save(sim_repertoire, file="data/simulated_repertoires/00_first_test")
+#
+# plot_report_repertoire(sim_repertoire, output_dir = "data/simulated_repertoires/")
+
+load("data/simulated_repertoires/00_first_test")
+

The immuneSIM function outputs an R dataframe containing 20 columns and rows equal to the number of sequences simulated. Per sequence immuneSIM provides the following information:

+
    +
  • Full VDJ sequence (nucleotide and amino acid): sequence, sequence_aa
  • +
  • CDR3 junctional sequence (nt and aa): junction, junction_aa
  • +
  • VDJ genes used in the recombination event: v_call, d_call, j_call
  • +
  • Nucleotide insertions VD and DJ: np1, np2
  • +
  • Length of deletion in V, D and J genes: del_v, del_d_5, del_d_3, del_j
  • +
  • CDR3 subsequences from V,D and J genes: v_sequence_alignment, d_sequence_alignment, j_sequence_alignment
  • +
  • Clonal frequency/count information: freqs, counts
  • +
  • Summary of somatic hypermutation (SHM) event simulated (only for BCR): shm_events
  • +
  • Given name of repertoire: name_repertoire
  • +
+
datatable(sim_repertoire,
+              class = 'nowrap compact order-column',
+              extensions = c('Buttons',  'FixedColumns'),
+              options = list(pageLength = 10,
+                             lengthMenu = c(10, 20, 50, 100),
+                             dom = 'Blfrtip',
+                             buttons = c('csv', 'excel', 'colvis'),
+                             scrollX = TRUE,
+                             fixedColumns = TRUE,
+                             paging = TRUE))
+
+ +

It also generates three plots with the following information about the repertoire composition:

+
    +
  • Aminoacid frequency per HVR position
  • +
+
+ + +
+
    +
  • VDJ length distribution
  • +
+
+ + +
+
    +
  • V, D and J segments usage
  • +
+
+ + +
+
+
+
+

2 Ion Torrent sequencing simulation

+
+

CuReSim

+ +

CuReSim (Customized Read Simulator) is a customized tool which generates synthetic NGS reads, supporting read simulation for major letter-base sequencing platforms.

+

The main features of CuReSim include:

+
    +
  • Genome (fasta) or read (fastq) as input file.
  • +
  • Choice between several error distributions.
  • +
  • A particular attention has been paid to special cases for which several introduced errors in the same read can result in less number of errors as expected due to compensatory changes.
  • +
  • Generation of diagrams to know exactly the simulated error model (R is required).
  • +
+

For CuReSim input a .fastq file with the simulated TCR sequences (multiplied by their respective counts) is generated. Specifically, reverse complement sequences are required to mimic our experimental data.

+
######## Generate .fastq file for CuReSim #######
+seqs <- as.character(sim_repertoire$sequence)
+counts <- sim_repertoire$counts
+
+reads <- DNAStringSet(rep(seqs, counts))
+names(reads) <- seq(1, length(reads))
+
+reads_rc <- reverseComplement(reads)
+
+# writeXStringSet(reads_rc, "software/CuReSim/input/00_first_test.fastq", format = "fastq")
+
+print(paste0("Number of reads: ", length(reads_rc)))
+
## [1] "Number of reads: 1643918"
+
+

Heads up! immuneSIM generates full-length VDJ sequences (~350 bp), while our reads contain also part of the first exon of segment C, along with the barcode and adapters sequences (~450 bp). We could introduce manually those extra nucleotides to make the simulated data even more similar to the experimental sequences.

+
+
+

Methods overview

+
    +
  1. Input file pre-processing: not required in our case since the input is not a genome, but directly the reads without errors.
  2. +
  3. Indel generation: user-defined rates. By default an iterative algorithm mostly introduces indels in the longer homopolymers.
  4. +
  5. Substitution generation: user-defined rate. By default substitution probability increases at the end of the read.
  6. +
  7. Correction step: to avoid compensatory changes that reduce the number of expected errors (i.e. deletion of an inserted base or substitution of an insertion).
  8. +
+
+
+

Parameters

+

Options are given with default values in brackets.

+

java -jar CuReSim.jar [options] -f <input_file> [options]

+
    +
  • f (String) genome fasta file or reads fastq file. It is the only MANDATORY field
  • +
  • o (String) name of output fastq file [output.fastq]
  • +
  • n (integer) number of reads to generate [50000]
  • +
  • m (integer) read mean size [200 bases]
  • +
  • sd (float) standard deviation for read size [20.0]
  • +
  • r (integer) number of random reads [0]
  • +
  • d (float) deletion rate [0.01]
  • +
  • i (float) insertion rate [0.005]
  • +
  • s (float) substitution rate [0.005]
  • +
  • ui when option -ui is added uniform distribution is drawn for indels [homopolymers]
  • +
  • us when option -us is added uniform distribution is drawn for substitutions [exponential]
  • +
  • q (character) quality encoding character in fastq file [5]
  • +
  • v verbose mode generating diagrams. R software is required [false]
  • +
  • skip skip the correction step [false]
  • +
  • h print this help
  • +
+

Default values for deletion (1%), insertion (0.5%) and substitution (0.5%) rates are those typical of IonTorrent technology (source).

+
+
+
+

Results

+ + + + + + +
+

Readlength distribution before and after sequencing simulation

+
rl_before <- ggplot() +
+  aes(width(reads_rc)) +
+  geom_histogram(color="dodgerblue", fill="dodgerblue", binwidth = 1) +
+  scale_y_continuous(name = "Counts", expand = c(0.01,0)) +
+  scale_x_continuous("Read length", expand = c(0.01,0)) +
+  ggtitle("Before") +
+  theme_pubr()
+
### nohup java -jar CuReSim.jar -f ../input/00_first_test.fastq -d 0.01 -i 0.005 -s 0.005 -o ../output/00_first_test.fastq -v &
+
+curesim_fq <- ShortRead::readFastq("software/CuReSim/output/00_first_test.fastq") # Read .fq file and store in a ShortReadQ class object
+reads_sim <- ShortRead::sread(curesim_fq) # DNAStringSet with the reads
+quality_sim <- quality(curesim_fq) # BStringSet with the sequencing qualities
+
+new.quality.class <- switch(class(quality_sim), # Convert from BStringSet to XStringQuality
+                                      SFastqQuality="SolexaQuality",
+                                      FastqQuality="PhredQuality",
+                                      "XStringQuality")
+quality_sim <- as(quality_sim, new.quality.class)
+
+sample_sim <- QualityScaledDNAStringSet(reads_sim, quality_sim) # Get QualityScaledDNAStringSet to use as a pairwiseAlignment input
+names(sample_sim) <- as.character(curesim_fq@id) # Character vector with the reads IDs
+
+sample_sim_rc <- reverseComplement(sample_sim)
+
+# Readlength histogram
+rl_after <- ggplot() +
+  aes(width(sample_sim_rc)) +
+  geom_histogram(color="dodgerblue", fill="dodgerblue", binwidth = 1) +
+  scale_y_continuous(name = "Counts", expand = c(0.01,0)) +
+  scale_x_continuous("Read length", expand = c(0.01,0)) +
+  ggtitle("After") +
+  theme_pubr()
+
+###
+rm(reads_sim, quality_sim, sample_sim, curesim_fq)
+
rl_before + rl_after
+

+
+
+
+
+

3 Applying our pipeline

+
+

VJ alignment

+
######################################################
+#################### VJ alignment ####################
+######################################################
+
+### VJ_alignment.R script executed via terminal (nohup)
+
+print("Execution time: 14.5789240725173 hours")
+
## [1] "Execution time: 14.5789240725173 hours"
+
vj_alg_sim <- readRDS("data/simulated_repertoires/VJ_alignment_first_sim_rep.rds") # Data too big for datatable (RStudio crashes)
+
+

Heads up! Sample 111L had ~200,000 reads (~2 hours for VJ alignment), while our simulated repertoire of 1000 different HVR has a total count of ~1,600,000 reads. immuneSIM does not have a specific parameter for total counts or sequencing coverage.

+
+
+

Alignment summary

+
###################################################### (4)
+################# VJ alignment results ###############
+###################################################### (4)
+
+alg_rep_data <- select(vj_alg_sim,
+                       V_score,
+                       J_score,
+                       Cys_check,
+                       Phe_check,
+                       HVR_frame)
+
+alg_rep_data$HVR_status <- ifelse((alg_rep_data$V_score < 0 | alg_rep_data$J_score < 0 | !alg_rep_data$Cys_check | !alg_rep_data$Phe_check), 
+                                  "HVR not found", 
+                                  "HVR found")
+alg_rep_data$label <- NA
+alg_rep_data[alg_rep_data$V_score < 0, "label"] <- "No V"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score < 0), "label"] <- "No J"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & !alg_rep_data$Cys_check & alg_rep_data$Phe_check), "label"] <- "No Cys"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & alg_rep_data$Cys_check & !alg_rep_data$Phe_check), "label"] <- "No Phe"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & !alg_rep_data$Cys_check & !alg_rep_data$Phe_check), "label"] <- "No Cys no Phe"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & alg_rep_data$Cys_check & alg_rep_data$Phe_check), "label"] <- paste("Frame",  alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & alg_rep_data$Cys_check & alg_rep_data$Phe_check), "HVR_frame"])
+
+PieDonut(alg_rep_data, aes(HVR_status,label),
+         showPieName=FALSE,
+         labelposition = 1,
+         showRatioThreshold = 0.009,
+         color = "white",
+         explode = 2,
+         explodeDonut = TRUE,
+         explodePie = TRUE,
+         r0 = 0,
+         r1 = 0.9,
+         start = pi/2,
+         maxx = 1.6,
+         explodePos = 0,
+         donutLabelSize = 3.5,
+         showRatioDonut = FALSE,
+         title = "VJ alignment (simulated repertoire)")
+

+
df1 <- as.data.frame(table(alg_rep_data$HVR_status))
+colnames(df1) <- c("Status", "# Reads")
+df2 <- as.data.frame(table(alg_rep_data$label))
+colnames(df2) <- c("Status", "# Reads")
+knitr::kable(df1)
+ + + + + + + + + + + + + + + + + +
Status# Reads
HVR found1555379
HVR not found88539
+
knitr::kable(df2)
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Status# Reads
Frame 0492201
Frame 1514612
Frame 2548566
No Cys14071
No Cys no Phe681
No Phe73787
+

HVR can be delimited if V and J segments and their conserved Cys and Phe codons are identified in the read. This is the case for most of the reads (94.6%). However, the proportion of the three possible HVR reading frames does not resemble that of the real repertoires analyzed. Both samples 111H and 111L had a large proportion of HVRs in frame (frame 0), while the simulated repertoire reading frames have the same frequency.

+
+

Heads up! Sequencing error rates need to be tuned. We could try and estimate them from the VJ alignments of real repertoires and/or try a different Ion Torrent sequencing simulator.

+
+
+
+

Unique reads

+

Reads with delimited HVR (1,555,379 reads) can be grouped into unique clonotypes (same V and J match and HVR sequence). This results in 84,412 unique reads:

+
###################################################### (5)
+################## Unique reads table ################
+###################################################### (5)
+
+vj_alg_good <- vj_alg_sim[!(vj_alg_sim$V_score < 0 | vj_alg_sim$J_score < 0 | !vj_alg_sim$Cys_check | !vj_alg_sim$Phe_check),]
+
+vj_alg_good_splt <- split(vj_alg_good, paste0(vj_alg_good$V_match, " / ", 
+                                   vj_alg_good$HVR_sequence, " / ", 
+                                   vj_alg_good$J_match))
+
+vj_alg_unique <- dplyr::bind_rows(lapply(vj_alg_good_splt, function(x){
+  
+  qual_mat <- do.call(rbind, lapply(x[,"HVR_quality"], function(y){strtoi(charToRaw(y),16L)-33}))
+  qual_med <- round(robustbase::colMedians(qual_mat))
+  qual_ascii <- rawToChar(as.raw(qual_med+33))
+  df_row <- x[1,]
+  df_row <- subset(df_row, select=-HVR_quality)
+  df_row$HVR_quality_median <- qual_ascii
+  df_row$Counts <- nrow(x)
+  
+  return(df_row)
+  
+}))
+
+
+vj_alg_unique <- dplyr::select(vj_alg_unique,
+                               c(V_match,
+                                 J_match,
+                                 HVR_sequence,
+                                 HVR_quality_median,
+                                 HVR_frame,
+                                 Counts))
+
+
+# DT::datatable(vj_alg_unique, # Data too big for datatables, although it can be generated
+#               class = 'nowrap compact order-column',
+#               extensions = c('Buttons',  'FixedColumns'),
+#               options = list(pageLength = 10,
+#                              lengthMenu = c(10, 20, 50, 100),
+#                              dom = 'Blfrtip',
+#                              buttons = c('csv', 'excel', 'colvis'),
+#                              scrollX = TRUE,
+#                              fixedColumns = TRUE,
+#                              paging = TRUE))
+
+
+

VJ families

+

There are 371 VJ families in the sample. A heatmap with the number of unique HVR sequences per VJ family is shown here:

+
###################################################### (6)
+######### Heatmap unique reads per VJ family #########
+###################################################### (6)
+
+vj_mat <- as.data.frame(table(vj_alg_unique[,c("V_match", "J_match")]))
+vj_mat[vj_mat == 0] <- NA
+
+vj_mat$V_match <- factor(vj_mat$V_match, levels = rev(str_sort(unique(vj_mat$V_match), numeric = TRUE)))
+vj_mat$J_match <- factor(vj_mat$J_match, levels = str_sort(unique(vj_mat$J_match), numeric = TRUE))
+
+
+vj_heatmap <- ggplot(vj_mat, aes(J_match, V_match, fill = Freq)) +
+  geom_tile(color = "white") +
+  coord_equal() +
+  geom_text(aes(label = Freq), size = 3) +
+  scale_x_discrete(expand = c(0,0), name = "J match") +
+  scale_y_discrete(expand = c(0,0), name = "V match") +
+  scale_fill_gradient(low = "aquamarine3", high = "red", name = "Unique HVR count", na.value = "gray90") +
+  theme_pubr() +
+  theme(axis.text.x = element_text(angle = 45, vjust = 1, hjust = 1),
+        text = element_text(size = 10))
+
+vj_heatmap
+

+
+
+

One-membered families

+

53 VJ families with only one HVR sequence are excluded from the clustering step. These families are shown here:

+
data_ec <- vj_alg_good
+### Unique reads
+data_ec_uniq <- plyr::ddply(data_ec,.(V_match, J_match, HVR_sequence, HVR_frame), nrow)
+data_ec_uniq <- data_ec_uniq %>% dplyr::rename(Counts = V1)
+
+vj_fam <- split(data_ec_uniq, paste0(data_ec_uniq$V_match, " / ", data_ec_uniq$J_match)) # Split data frame by VJ match into list of data frames
+
+### Single-member VJ families
+single_idx <- unlist(lapply(vj_fam, function(x){nrow(x) == 1})) # Logic vector for one-membered families
+vj_sgl_member <- bind_rows(vj_fam[single_idx]) # Data frame with one member clonotypes
+
+DT::datatable(vj_sgl_member,
+              class = 'nowrap compact order-column',
+              extensions = c('Buttons',  'FixedColumns'),
+              options = list(pageLength = 10,
+                             lengthMenu = c(10, 20, 50, 100),
+                             dom = 'Blfrtip',
+                             buttons = c('csv', 'excel', 'colvis'),
+                             scrollX = TRUE,
+                             fixedColumns = TRUE,
+                             paging = TRUE))
+
+ +

Therefore, 318 VJ families would undergo the clustering step.

+
+
+
+

Dendrograms

+

Dendrograms of 82/318 VJ families with more than one distinct HVR sequence are shown here (also available in /media/bacon/Carazo_TCRSeq_IonTorrentS5/03_sequenceAnalysis/april_2020/plots/dendrograms_sim_rep_weighted_hclust_wardD). The method used was a weighted hierarchical clustering with ward.D linkage, as it showed to be the best linkage method for sample 111H.0

+

Note: only 82 dendrograms are available because execution halts trying to generate plots for very large (>1000 HVRs) VJ families. Will not fix this since those dendrograms would be unintelligible anyway. 82 dendrograms should be a sufficient sample to compare in silico VJ families to real ones.

+
######################################################
+################## Plot dendrograms ##################
+###################################################### 
+
+# dendro_weighted_clust <- function(data_ec, msa_dir, plot_dir, linkage){
+#   
+#   #########################################
+#   ############# Prepare data ##############
+#   #########################################
+#   
+#   ### Unique reads
+#   data_ec_uniq <- plyr::ddply(data_ec,.(V_match, J_match, HVR_sequence, HVR_frame), nrow)
+#   data_ec_uniq <- data_ec_uniq %>% dplyr::rename(Counts = V1)
+#   
+#   vj_fam <- split(data_ec_uniq, paste0(data_ec_uniq$V_match, " / ", data_ec_uniq$J_match)) # Split data frame by VJ match into list of data frames
+# 
+#   ### Remove single-member VJ families
+#   single_idx <- unlist(lapply(vj_fam, function(x){nrow(x) == 1})) # Logic vector for one-membered families
+#   vj_sgl_member <- bind_rows(vj_fam[single_idx]) # Data frame with one member clonotypes
+#   
+#   ### List of data frames with VJ families with more than one clonotype
+#   vj_groups <- vj_fam[!single_idx] 
+#   vj_groups <- lapply(vj_groups, function(x){
+#     df <- x
+#     rownames(df) <- 1:nrow(df)
+#     return(df)
+#   })
+#   
+#   ### Create DNAStringSet
+#   vj_groups_dss <- lapply(vj_groups, function(x){ # List of QualityScaledDNAStringSet with VJ families with more than one clonotype
+#   dss <- DNAStringSet(x[,"HVR_sequence"]) # Sequences
+#   ids <- rownames(x)
+#   names(dss) <- ids
+#   return(dss)
+#   })
+#   
+# 
+#   ########################################
+#   ############ Generate plots ############
+#   ########################################
+# 
+#   lapply(1:length(vj_groups), function(idx){
+# 
+#     v_name <- gsub("_.*", "", vj_groups[[idx]][1,"V_match"])
+#     j_name <- gsub("_.*", "", vj_groups[[idx]][1,"J_match"])
+# 
+#     ### MSA ###
+# 
+#     hvr_msa <- invisible(DNAStringSet(msaClustalW(vj_groups_dss[idx][[1]],
+#                                         gapOpening = 1)))
+# 
+#     msa_path <- paste0(msa_dir, "hvr_msa_", v_name, "_", j_name, ".fasta")
+#     writeXStringSet(hvr_msa, msa_path)
+# 
+#     ### LEVENSHTEIN DISTANCE ###
+# 
+#     df <- vj_groups_dss[idx][[1]]
+#     ld <- stringDist(df, method = "levenshtein", upper = TRUE, diag = TRUE)
+# 
+#     ### HIERARCHICAL CLUSTERING ###
+#     ld_hc <- hclust(ld, method = linkage, members = vj_groups[[idx]][,"Counts"])
+# 
+#     ### GGTREE ###
+# 
+#     p <- ggtree(ld_hc)
+# 
+#     d <- data.frame(label = rownames(vj_groups[[idx]]),
+#                     HVR_frame = vj_groups[[idx]][, "HVR_frame"],
+#                     Counts = vj_groups[[idx]][, "Counts"])
+# 
+#     mycols <- c("mediumseagreen", "orange2", "firebrick2")
+#     names(mycols) <- c("0", "1", "2")
+#     p2 <- p %<+% d +
+#       geom_tiplab() +
+#       geom_point(aes(color=factor(HVR_frame, levels = c(0, 1, 2)), size = Counts, x=x+(x*0.18))) +
+#       scale_color_manual(values = mycols, name = "HVR frame")
+#     
+# 
+#     m <- msaplot(p2, fasta = msa_path,
+#             offset = max(ld_hc$height) * 0.125,
+#             width = 2)
+# 
+#     nuc_colors <- c(NA, "#a2fa8c", "#ffd18c", "#f38d8a", "#8ab8f5")
+#     names(nuc_colors) <- c("-", "a", "c", "g", "t")
+#     m <- m +
+#       scale_fill_manual(values = nuc_colors, name = "Nucleotide") +
+#       ggtitle(paste(v_name, "/", j_name, "family"))
+# 
+#     ggsave(filename = paste0(plot_dir, v_name, "_", j_name, ".png"),
+#            plot = m,
+#            width = 10,
+#            height = 5 + nrow(vj_groups[[idx]])*0.06,
+#            limitsize = FALSE)
+#     })
+# }
+
############ ERROR: stops at 82 dendrograms. Probably could not generate png in large VJ family (>1000 HVRs) as it could not allocate the file in memory. 
+
+# dendro_weighted_clust(vj_alg_good,
+#                       msa_dir = "plots/dendrograms_sim_rep_weighted_hclust_wardD/MSA/",
+#                       plot_dir = "plots/dendrograms_sim_rep_weighted_hclust_wardD/",
+#                       linkage = "ward.D")
+
dendro_plots <- paste0(list.files("plots/dendrograms_sim_rep_weighted_hclust_wardD", full.names = TRUE, pattern = "*.png"))
+names(dendro_plots) <- str_replace_all(dendro_plots, 
+                                      c("\\.png" = "", 
+                                        "plots/dendrograms_sim_rep_weighted_hclust_wardD/" = ""))
+
+bsselect(dendro_plots, type = "img", selected = NULL,
+         show_tick = TRUE, frame_height = "100%",
+         dropup_auto = FALSE, size = 10,
+         height = 50)
+ + + + + + +
+ +
+
+
+

4 Tunning simulated sequencing error rates New

+

Default CuReSim error rates for Ion Torrent technology are 1% deletion, 0.5% insertion and 0.5% substitution, but these values are extracted from 2012 publications (source 1, 2, 3) that worked with old chips of the Ion Torrent PGM platform. Our TCR sequences were obtained with the newer Ion Torrent S5 platform (chip 530), which generates more high-quality reads than the PGM (source). However, S5 error rates could not be found in the literature.

+

Ideas for error rate values testing:

+
    +
  • According to CuReSim publication "precision and recall values were closer to the values obtained for the real dataset values when reads were generated with 0.5% deletions, 0.25% insertions, and 0.25% substitutions".
  • +
  • In this publication three Ion Torrent PGM sequencing kits were compared in terms of error rates (deletion / insertion / substitution):
  • +
  • 100 bp One Touch: 0.8% / 0.84% / 0.04%
  • +
  • ~200 bp Manual: 1.98% / 2.69% / 0.17 %~ (discarded, higher indel rates than CuReSim default).
  • +
  • ~200 bp One Touch: 1.07% / 1.76% / 0.07%~ (discarded, higher indel rates than CuReSim default).
  • +
  • In this publication the error rates are estimated with hepatitis B virus genome: 0.13% / 0.27% / ~0.08%.
  • +
+

We tried this last configuration:

+
    +
  • Deletion: 0.13%
  • +
  • Insertion: 0.27%
  • +
  • Substitution: 0.08%
  • +
+
+

CuReSim results

+

+
### nohup java -jar CuReSim.jar -f ../input/00_first_test.fastq -d 0.0013 -i 0.0027 -s 0.0008 -o ../output/01_HCV_error_rates_d013_i027_s008.fastq -v &
+
+curesim_fq <- ShortRead::readFastq("software/CuReSim/output/01_HCV_error_rates_d013_i027_s008.fastq") # Read .fq file and store in a ShortReadQ class object
+reads_sim <- ShortRead::sread(curesim_fq) # DNAStringSet with the reads
+quality_sim <- quality(curesim_fq) # BStringSet with the sequencing qualities
+
+new.quality.class <- switch(class(quality_sim), # Convert from BStringSet to XStringQuality
+                                      SFastqQuality="SolexaQuality",
+                                      FastqQuality="PhredQuality",
+                                      "XStringQuality")
+quality_sim <- as(quality_sim, new.quality.class)
+
+sample_sim <- QualityScaledDNAStringSet(reads_sim, quality_sim) # Get QualityScaledDNAStringSet to use as a pairwiseAlignment input
+names(sample_sim) <- as.character(curesim_fq@id) # Character vector with the reads IDs
+
+sample_sim_rc <- reverseComplement(sample_sim)
+
+# Readlength histogram
+rl_after <- ggplot() +
+  aes(width(sample_sim_rc)) +
+  geom_histogram(color="dodgerblue", fill="dodgerblue", binwidth = 1) +
+  scale_y_continuous(name = "Counts", expand = c(0.01,0)) +
+  scale_x_continuous("Read length", expand = c(0.01,0)) +
+  ggtitle("After") +
+  theme_pubr()
+
+###
+rm(reads_sim, quality_sim, sample_sim, curesim_fq)
+

Readlength before and after CuReSim:

+
rl_before + rl_after
+

+
+
+

VJ alignment

+
######################################################
+#################### VJ alignment ####################
+######################################################
+ 
+### VJ_alignment.R script executed via terminal (nohup)
+
+print("Execution time: 14.691883502139 hours")
+
## [1] "Execution time: 14.691883502139 hours"
+
vj_alg_sim_01 <- readRDS("data/simulated_repertoires/01_VJ_alignment_HCV_error_rates.rds") # Data too big for datatable (RStudio crashes)
+
+

Alignment summary

+
###################################################### (4)
+################# VJ alignment results ###############
+###################################################### (4)
+
+alg_rep_data <- select(vj_alg_sim_01,
+                       V_score,
+                       J_score,
+                       Cys_check,
+                       Phe_check,
+                       HVR_frame)
+
+alg_rep_data$HVR_status <- ifelse((alg_rep_data$V_score < 0 | alg_rep_data$J_score < 0 | !alg_rep_data$Cys_check | !alg_rep_data$Phe_check), 
+                                  "HVR not found", 
+                                  "HVR found")
+alg_rep_data$label <- NA
+alg_rep_data[alg_rep_data$V_score < 0, "label"] <- "No V"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score < 0), "label"] <- "No J"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & !alg_rep_data$Cys_check & alg_rep_data$Phe_check), "label"] <- "No Cys"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & alg_rep_data$Cys_check & !alg_rep_data$Phe_check), "label"] <- "No Phe"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & !alg_rep_data$Cys_check & !alg_rep_data$Phe_check), "label"] <- "No Cys no Phe"
+alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & alg_rep_data$Cys_check & alg_rep_data$Phe_check), "label"] <- paste("Frame",  alg_rep_data[(alg_rep_data$V_score > 0 & alg_rep_data$J_score > 0 & alg_rep_data$Cys_check & alg_rep_data$Phe_check), "HVR_frame"])
+
+PieDonut(alg_rep_data, aes(HVR_status,label),
+         showPieName=FALSE,
+         labelposition = 1,
+         showRatioThreshold = 0.009,
+         color = "white",
+         explode = 2,
+         explodeDonut = TRUE,
+         explodePie = TRUE,
+         r0 = 0,
+         r1 = 0.9,
+         start = pi/2,
+         maxx = 1.6,
+         explodePos = 0,
+         donutLabelSize = 3.5,
+         showRatioDonut = FALSE,
+         title = "VJ alignment (simulated repertoire, HCV error rates)")
+

+
df1 <- as.data.frame(table(alg_rep_data$HVR_status))
+colnames(df1) <- c("Status", "# Reads")
+df2 <- as.data.frame(table(alg_rep_data$label))
+colnames(df2) <- c("Status", "# Reads")
+knitr::kable(df1)
+ + + + + + + + + + + + + + + + + +
Status# Reads
HVR found1595806
HVR not found48112
+
knitr::kable(df2)
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Status# Reads
Frame 0628448
Frame 1545218
Frame 2422140
No Phe48112
+

Despite having considerably reduced error rates, out-of-frame HVRs still have a higher frequency than expected.

+

Let's compare the VJ alignment score and identity distributions among a real repertoire (111L, ~200k reads) and the two simulated ones (~1.5M reads each):

+
vj_alg_111L <- readRDS("data/vj_alignment_sample_111L.rds")
+
+sc_id_comp <- do.call(rbind, list("111L" = select(vj_alg_111L, c("V_score", "V_identity", "J_score", "J_identity")),
+                    "sim_00" = select(vj_alg_sim, c("V_score", "V_identity", "J_score", "J_identity")),
+                    "sim_01" = select(vj_alg_sim_01, c("V_score", "V_identity", "J_score", "J_identity"))))
+
+sc_id_comp$Sample <- as.factor(sub("\\..*", "", rownames(sc_id_comp)))
+
+sc_id_comp.m <- melt(sc_id_comp, id.vars = "Sample")
+
+
+calc_stat <- function(x) {
+  coef <- 1.5
+  n <- sum(!is.na(x))
+  # calculate quantiles
+  stats <- quantile(x, probs = c(0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 0.9))
+  names(stats) <- c("ymin", "lower", "middle", "upper", "ymax")
+  return(stats)
+}
+
+sc_id_comp_plt <- ggplot(sc_id_comp.m, aes(x = Sample, y = value, color = Sample)) +
+  stat_summary(fun.data = calc_stat, geom="boxplot") + 
+  # geom_boxplot(outlier.shape = NA) +
+  # scale_y_continuous() +
+  # scale_x_continuous(name = "Bin", breaks = seq(-10, -1)) +
+  # scale_color_manual(name = "Reading frame", values = c("mediumseagreen", "orange", "orangered")) +
+  facet_wrap(. ~ variable, scales = "free") +
+  theme_pubr()
+sc_id_comp_plt
+
## Warning: Removed 122 rows containing non-finite values (stat_summary).
+
+Outliers have been removed from these plots. +

+Outliers have been removed from these plots. +

+
+

In our reads, sequencing goes from C segment to V segment (C-J-HVR-V). Simulated reads were reverse complemented to mimic this situation (J-HVR-V). However, simulated reads lack the portion of segment C and therefore are ~100 bp shorter. Conclusions that could be extracted from this:

+
    +
  1. V score and identity is lower in 111H because reads are larger and V is located at the end.
  2. +
  3. J score and identity is higher in 111H maybe because error rates are still too high in the simulated repertoire (?). Since simulated samples have shorter reads, J is located at the beginning and its score and identity should be higher than that of real repertoires, not lower.
  4. +
+
+
+
+
+
+

Session info

+
sessionInfo()
+
## R version 3.6.1 (2019-07-05)
+## Platform: x86_64-pc-linux-gnu (64-bit)
+## Running under: Ubuntu 18.04.2 LTS
+## 
+## Matrix products: default
+## BLAS:   /usr/lib/x86_64-linux-gnu/openblas/libblas.so.3
+## LAPACK: /usr/lib/x86_64-linux-gnu/libopenblasp-r0.2.20.so
+## 
+## locale:
+##  [1] LC_CTYPE=en_US.UTF-8       LC_NUMERIC=C              
+##  [3] LC_TIME=en_US.UTF-8        LC_COLLATE=en_US.UTF-8    
+##  [5] LC_MONETARY=en_US.UTF-8    LC_MESSAGES=en_US.UTF-8   
+##  [7] LC_PAPER=en_US.UTF-8       LC_NAME=C                 
+##  [9] LC_ADDRESS=C               LC_TELEPHONE=C            
+## [11] LC_MEASUREMENT=en_US.UTF-8 LC_IDENTIFICATION=C       
+## 
+## attached base packages:
+## [1] stats4    parallel  stats     graphics  grDevices utils     datasets 
+## [8] methods   base     
+## 
+## other attached packages:
+##  [1] reshape2_1.4.4        apcluster_1.4.8       WeightedCluster_1.4-1
+##  [4] cluster_2.1.0         TraMineR_2.2-0.1      bsselectR_0.1.0      
+##  [7] stringr_1.4.0         ggtree_2.0.4          plyr_1.8.6           
+## [10] webr_0.1.5            dplyr_1.0.2           msa_1.16.0           
+## [13] patchwork_1.0.1       ggpubr_0.2.1          magrittr_1.5         
+## [16] ggplot2_3.3.2         Biostrings_2.52.0     XVector_0.24.0       
+## [19] IRanges_2.18.3        S4Vectors_0.22.1      BiocGenerics_0.30.0  
+## [22] DT_0.16               immuneSIM_0.8.7      
+## 
+## loaded via a namespace (and not attached):
+##   [1] uuid_0.1-4                  backports_1.2.0            
+##   [3] Hmisc_4.2-0                 systemfonts_0.3.2          
+##   [5] igraph_1.2.6                lazyeval_0.2.2             
+##   [7] splines_3.6.1               BiocParallel_1.18.1        
+##   [9] crosstalk_1.1.0.1           GenomeInfoDb_1.20.0        
+##  [11] digest_0.6.27               htmltools_0.5.0            
+##  [13] checkmate_2.0.0             Metrics_0.1.4              
+##  [15] readr_1.4.0                 matrixStats_0.57.0         
+##  [17] R.utils_2.10.1              officer_0.3.15             
+##  [19] jpeg_0.1-8.1                colorspace_1.4-1           
+##  [21] xfun_0.19                   RCurl_1.98-1.2             
+##  [23] crayon_1.3.4                jsonlite_1.7.1             
+##  [25] rrtable_0.2.1               survival_3.2-7             
+##  [27] zoo_1.8-8                   ape_5.4-1                  
+##  [29] glue_1.4.2                  polyclip_1.10-0            
+##  [31] rvg_0.2.5                   gtable_0.3.0               
+##  [33] zlibbioc_1.30.0             DelayedArray_0.10.0        
+##  [35] sjmisc_2.8.5                R.cache_0.14.0             
+##  [37] DEoptimR_1.0-8              scales_1.1.1               
+##  [39] ggthemes_4.2.0              miniUI_0.1.1.1             
+##  [41] Rcpp_1.0.5                  xtable_1.8-4               
+##  [43] htmlTable_2.1.0             tmvnsim_1.0-2              
+##  [45] tidytree_0.3.3              foreign_0.8-72             
+##  [47] Formula_1.2-4               vcd_1.4-8                  
+##  [49] htmlwidgets_1.5.2           httr_1.4.2                 
+##  [51] RColorBrewer_1.1-2          acepack_1.4.1              
+##  [53] ellipsis_0.3.1              pkgconfig_2.0.3            
+##  [55] R.methodsS3_1.8.1           farver_2.0.3               
+##  [57] nnet_7.3-12                 labeling_0.4.2             
+##  [59] tidyselect_1.1.0            rlang_0.4.8                
+##  [61] later_1.1.0.1               munsell_0.5.0              
+##  [63] tools_3.6.1                 generics_0.1.0             
+##  [65] devEMF_4.0-2                sjlabelled_1.1.7           
+##  [67] moonBook_0.2.3              evaluate_0.14              
+##  [69] fastmap_1.0.1               yaml_2.2.1                 
+##  [71] knitr_1.30                  robustbase_0.93-6          
+##  [73] zip_2.1.1                   purrr_0.3.4                
+##  [75] nlme_3.1-140                mime_0.9                   
+##  [77] R.oo_1.24.0                 poweRlaw_0.70.6            
+##  [79] pracma_2.2.9                xml2_1.3.2                 
+##  [81] compiler_3.6.1              rstudioapi_0.11            
+##  [83] png_0.1-7                   ggsignif_0.5.0             
+##  [85] treeio_1.8.2                tibble_3.0.4               
+##  [87] tweenr_1.0.1                stringi_1.5.3              
+##  [89] highr_0.8                   gdtools_0.2.2              
+##  [91] lattice_0.20-38             Matrix_1.2-17              
+##  [93] psych_2.0.9                 vctrs_0.3.4                
+##  [95] stringdist_0.9.6.3          pillar_1.4.6               
+##  [97] lifecycle_0.2.0             BiocManager_1.30.10        
+##  [99] editData_0.1.2              lmtest_0.9-38              
+## [101] bitops_1.0-6                data.table_1.13.2          
+## [103] insight_0.10.0              flextable_0.5.11           
+## [105] ztable_0.2.2                GenomicRanges_1.36.1       
+## [107] httpuv_1.5.4                hwriter_1.3.2              
+## [109] R6_2.5.0                    latticeExtra_0.6-29        
+## [111] ShortRead_1.42.0            promises_1.1.1             
+## [113] gridExtra_2.3               boot_1.3-23                
+## [115] MASS_7.3-51.1               SummarizedExperiment_1.14.1
+## [117] shinyWidgets_0.5.4          withr_2.3.0                
+## [119] Rsamtools_2.0.3             GenomicAlignments_1.20.1   
+## [121] mnormt_2.0.2                GenomeInfoDbData_1.2.1     
+## [123] hms_0.5.3                   repmis_0.5                 
+## [125] grid_3.6.1                  rpart_4.1-15               
+## [127] tidyr_1.1.2                 rmarkdown_2.5              
+## [129] rvcheck_0.1.8               ggforce_0.3.1              
+## [131] Biobase_2.44.0              shiny_1.5.0                
+## [133] base64enc_0.1-3
+
+ + + +
+
+ +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + diff --git a/data/vj_alignment/example_reads.rds b/data/vj_alignment/example_reads.rds new file mode 100644 index 0000000..5e19d74 Binary files /dev/null and b/data/vj_alignment/example_reads.rds differ diff --git a/data/vj_alignment/j_segments_phe.rds b/data/vj_alignment/j_segments_phe.rds new file mode 100644 index 0000000..3f8b40f Binary files /dev/null and b/data/vj_alignment/j_segments_phe.rds differ diff --git a/data/vj_alignment/v_segments.rds b/data/vj_alignment/v_segments.rds new file mode 100644 index 0000000..ea60b3a Binary files /dev/null and b/data/vj_alignment/v_segments.rds differ diff --git a/data/vj_alignment/vj_alignment_viz.html b/data/vj_alignment/vj_alignment_viz.html new file mode 100644 index 0000000..2002b90 --- /dev/null +++ b/data/vj_alignment/vj_alignment_viz.html @@ -0,0 +1,809 @@ + + + + + + + + + + + + + + + +V and J segments alignment visualization + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + +
+
+
+
+
+ +
+ + + + + + + +

Load libraries:

+
########## LOAD LIBRARIES ###########
+library(Biostrings)
+library(msaR)
+library(msa)
+library(stringr)
+library(dplyr)
+
+

1 V and J alignment

+
+

1.1 vj_alignment function

+

The vj_alignment function performs the V and J alignments in the TCRβ reads to delimit their HVR.

+
vj_alignment <- function(reads, Vsegments, Jsegments, numCores = detectCores() - 4, gapOpening = 1){
+  #' Align V and J segments in a set of reads to delimit the hypervariable region (HVR)
+  #' 
+  #' @param reads A \code{DNAStringSet} or a \code{QualityScaledDNAStringSet} containing the reads.
+  #' @param Vsegments A \code{DNAStringSet} with the V segments.
+  #' @param Jsegments A \code{DNAStringSet} with the J segments trimmed from the Phe codon.
+  #' @param numCores Number of cores to execute the function in parallel.
+  #' @param gapOpening Penalty for opening a gap in the alignment.
+  #' @return A \code{data.frame} with V and J alignment information and HVR sequence, quality and reading frame.
+  
+  results <- dplyr::bind_rows(mclapply(mc.cores = numCores, X = 1:length(reads), FUN = function(i){
+    
+  read <- reads[i]  
+  
+  # Get the read ID
+  read_id <- names(read)
+  
+
+  #########################################
+  ############## V ALIGNMENT ##############
+  #########################################
+  
+  ### Remove IMGT gaps before alignment to avoid them affecting the score ###
+  Vsegments_nogaps <- DNAStringSet(gsub("\\.", "", Vsegments))
+  names(Vsegments_nogaps) <- names(Vsegments)
+  
+  ### Perform 147 V alignments and get the score only (NO IMGT GAPS) ###
+  v_alignment1 <- pairwiseAlignment(pattern = Vsegments_nogaps, 
+                                 subject = read,
+                                 type = "global-local",
+                                 scoreOnly = TRUE,
+                                 gapOpening = gapOpening)
+  
+  ### Select the segment with the best score ###
+  best_v <- Vsegments[which.max(v_alignment1)]
+  v_match <- names(best_v)
+  
+  ### Perform a complete pairwise alignment with the best match (W/ IMGT GAPS, for Cys location) ###
+  v_alignment2 <- pairwiseAlignment(pattern = best_v,
+                                 subject = read,
+                                 type = "global-local",
+                                 scoreOnly = FALSE,
+                                 gapOpening = gapOpening)
+  
+  ### Perform a complete pairwise alignment with the best match (NO IMGT GAPS) ###
+  best_v_nogaps <- DNAString(gsub("\\.", "", best_v))
+  
+  v_alignment3 <- pairwiseAlignment(pattern = best_v_nogaps,
+                                    subject = read,
+                                    type = "global-local",
+                                    scoreOnly = FALSE,
+                                    gapOpening = gapOpening)
+  
+  ### Get V alignment information ###
+  v_score <- score(v_alignment3) # Score of alignment with no gaps
+  v_identity <- pid(v_alignment3, type = "PID3")
+  v_start <- start(Views(v_alignment3))
+  v_end <- end(Views(v_alignment3))
+  
+
+  if (v_score < 0) { # If V score is negative, Cys check nor J alignment are performed 
+    
+    cys_check <- NA
+    cys_status <- NA
+
+    j_match <- NA
+    j_score <- NA
+    j_identity <- NA
+    j_start <- NA
+    j_end <- NA
+    phe_check <- NA
+    
+    read_cys_start <- NA
+    HVR_seq <- NA
+    HVR_qual <- NA
+    HVR_frame <- NA
+
+    
+  } else { # Only find Cys and align J if V score is positive
+  
+    #########################################
+    ####### FIND CYS, HANDLE INDELS #########
+    #########################################
+    
+    # Cys coordinates in the alignment, ideally
+    cys_start <- 310
+    cys_end <- 312
+    
+    # If there is any insertion in the read, Cys coordinates will be shifted in the alignment
+    v_ins <- unlist(deletion(v_alignment2)) # IRanges with V insertions
+    alg_cys_start <- cys_start + sum(width(v_ins[start(v_ins) <= cys_start])) # Cys start in alignment
+    alg_cys_end <- cys_end + sum(width(v_ins[start(v_ins) <= cys_end])) # Cys end in alignment
+    
+    message(alg_cys_start, " ", alg_cys_end)
+    
+    # Find Cys coordinates in the read
+    v_del <- unlist(insertion(v_alignment2)) # IRanges with deletions in subject (mostly IMGT gaps)
+    print(v_del)
+    num_v_del <- length(v_del) # Number of deletions (of any length)
+    shift <- c(0, cumsum(width(v_del))[-num_v_del]) 
+    v_del_sft <- shift(v_del, shift) # Fix coordinates
+    subject_gaps <- sum(width(v_del_sft[end(v_del_sft) < alg_cys_start])) + nchar(str_extract(alignedSubject(v_alignment2), "^-*")) # Number of gaps in subject before Cys in the alignment. The "nchar" term takes into account the gaps at the beginning of the subject, which are not considered by the "insertion" function.
+    
+    read_cys_start <- v_start + alg_cys_start - subject_gaps -1 # Cys start in the read
+    message(read_cys_start)
+    
+    # Get aligned Cys sequences in pattern and subject
+    cys_subject <- subseq(alignedSubject(v_alignment2), start = alg_cys_start, end = alg_cys_end) # Cys sequence in subject
+    message(cys_subject)
+    gap_subject <- unlist(gregexpr(pattern = "-", text = cys_subject)) # Gap position in subject (deletion), if any
+    
+    cys_pattern <- subseq(alignedPattern(v_alignment2), start = alg_cys_start, end = alg_cys_end) # Cys sequence in pattern
+    gap_pattern <- unlist(gregexpr(pattern = "-", text = cys_pattern)) # Gap position in pattern (insertion), if any
+    
+    # Check Cys sequence in subject
+    if (cys_subject %in% c("TGT", "TGC")) { # Cys codon found
+    
+      cys_check <- TRUE
+    
+      if (cys_subject == cys_pattern) { # Same Cys codon in pattern and subject
+        cys_status <- "Match"
+    
+      } else { # Different Cys codon in pattern and subject
+        cys_status <- paste0("Pseudomatch (", cys_pattern," > ", cys_subject, ")")
+      }
+    
+    } else if (all(gap_pattern > 0)) { # Insertion in subject, fix it by removing it
+      cys_status <- paste0("Insertion (", cys_pattern," > ", cys_subject, "), removed")
+    
+      read_ins_pos <- read_cys_start + as.numeric(gap_pattern) -1 # Insertion position in read
+      
+      # Delete insertion in read
+      fix_read <- as.character(read)
+      fix_qual <- quality(read)
+      stringr::str_sub(fix_read, read_ins_pos[1], read_ins_pos[length(read_ins_pos)]) <- "" # Remove Cys insertion in the read
+      stringr::str_sub(fix_qual, read_ins_pos[1], read_ins_pos[length(read_ins_pos)]) <- "" # Remove Cys insertion in the quality string
+      fix_qual <- as(fix_qual, new.quality.class) # Convert to PhredQuality class
+      read_id <- names(read)
+      read <- QualityScaledDNAStringSet(fix_read, fix_qual) # Rebuild QualityScaledDNAStringSet without Cys insertion
+      names(read) <- read_id
+      
+      cys_codon <- subseq(read, start = read_cys_start, end = read_cys_start + 2)
+      cys_check <- ifelse(cys_codon %in% c("TGT", "TGC"), TRUE, FALSE)
+      
+    } else if (all(gap_subject > 0)) { # Deletion in subject
+      cys_status <- paste0("Deletion (", cys_pattern," > ", cys_subject, ")")
+      cys_check <- FALSE
+    
+    } else { # Mismatch
+      cys_status <- paste0("Mismatch (", cys_pattern," > ", cys_subject, ")")
+      cys_check <- FALSE
+    }
+    
+    
+    
+    
+    
+    #########################################
+    ############## J ALIGNMENT ##############
+    #########################################
+    
+    ### Remove V match from the read
+    remaining <- subseq(read, start = read_cys_start + 3) # Align J from Cys codon (not included)
+    
+    ### Perform 16 J alignments and get the score only
+    j_alignment1 <- pairwiseAlignment(pattern = Jsegments, 
+                                   subject = remaining,
+                                   type = "global-local",
+                                   scoreOnly = TRUE,
+                                   gapOpening = gapOpening)
+    
+    ### Select the segment with the best score
+    best_j <- Jsegments[which.max(j_alignment1)]
+    j_match <- names(best_j)
+    
+    ### Perform a complete pairwise alignment with the best match
+    j_alignment2 <- pairwiseAlignment(pattern = best_j,
+                                   subject = remaining,
+                                   type = "global-local",
+                                   scoreOnly = FALSE,
+                                   gapOpening = gapOpening)
+    
+    ### Get J alignment information
+    j_score <- score(j_alignment2)
+    j_identity <- pid(j_alignment2, type = "PID3")
+    j_start <- start(Views(j_alignment2)) + read_cys_start + 2 # Get the coordinates **in the read**, not in the sequence without the V match
+    j_end <- end(Views(j_alignment2)) + read_cys_start + 2
+    
+    ### Check if the first codon is a Phe
+    phe_codon <- subseq(read, start = j_start, end = j_start + 2)
+    phe_check <- phe_codon %in% c("TTT", "TTC")
+    
+    
+
+    
+    #########################################
+    ############## HVR LOCATION #############
+    #########################################
+    
+    ### Get HVR sequence and sequencing quality
+    HVR <- subseq(read, start = read_cys_start, end = j_start + 2)
+    HVR_seq <- as.character(HVR)
+    HVR_qual <- as.character(quality(HVR))
+    
+    # Find out HVR frame (0: Cys and Phe in frame; 1 OR 2: out of frame)
+    HVR_frame <- nchar(HVR_seq) %% 3
+    
+    if (HVR_frame != 0) { # If the remainder is 1, frame = 2 and viceversa
+      HVR_frame <- ifelse(HVR_frame == 1, 2, 1)
+    }
+  }
+  
+  
+    
+  
+  #########################################
+  ################# OUTPUT ################
+  #########################################
+  
+  df <- data.frame(
+    read_ID = read_id,
+    read_length = width(read),
+    
+    V_match = v_match,
+    V_score = v_score,
+    V_identity = v_identity,
+    V_start = v_start,
+    Cys_check = cys_check,
+    Cys_status = cys_status,
+    
+    J_match = j_match,
+    J_score = j_score,
+    J_identity = j_identity,
+    J_end = j_end,
+    Phe_check = phe_check,
+    
+    HVR_start = read_cys_start,
+    HVR_end = j_start + 2,
+    HVR_sequence = HVR_seq,
+    HVR_quality = HVR_qual,
+    HVR_frame = HVR_frame
+    
+  ) %>% mutate(read_ID = as.character(read_ID),
+               V_match = as.character(V_match),
+               J_match = as.character(J_match),
+               Cys_status = as.character(Cys_status),
+               HVR_sequence = as.character(HVR_sequence),
+               HVR_quality = as.character(HVR_quality))
+
+  
+  return(df)
+  }))
+}
+
+
+

1.2 Run alignment

+

Load input:

+
    +
  • v_segments and j_segments: both are DNAStringset that contains the reference sequences for V (147 sequences: all 64 segments + alleles) and J segments (16 sequences).
  • +
  • examples: QualityScaledDNAStringSet that contains three example reads and their sequencing qualities. The reads have been previously reverse-complemented (!!!).
  • +
+
###############################################################################################
+####################### CONVERT .fastq TO QualityScaledDNAStringSet ###########################
+###############################################################################################
+
+# curesim_fq <- ShortRead::readFastq("software/CuReSim/output/00_first_test.fastq") # Read .fq file and store in a ShortReadQ class object
+# reads_sim <- ShortRead::sread(curesim_fq) # DNAStringSet with the reads
+# quality_sim <- quality(curesim_fq) # BStringSet with the sequencing qualities
+# 
+# new.quality.class <- switch(class(quality_sim), # Convert from BStringSet to XStringQuality
+#                                       SFastqQuality="SolexaQuality",
+#                                       FastqQuality="PhredQuality",
+#                                       "XStringQuality")
+# quality_sim <- as(quality_sim, new.quality.class)
+# 
+# sample_sim <- QualityScaledDNAStringSet(reads_sim, quality_sim) # Get QualityScaledDNAStringSet to use as a pairwiseAlignment input
+# names(sample_sim) <- as.character(curesim_fq@id) # Character vector with the reads IDs
+# 
+# sample_sim_rc <- reverseComplement(sample_sim) # V-CDR3-J
+

(!!!) ImmuneSIM-generated reads have the following structure: V-CDR3-J. To mimic the sequencing process of our collaborators, before CuReSim, reads need to be reverse-complemented (J-CDR3-V), so that CDR3 lies at the beginning of the read, where sequencing quality is better. However, to perform V and J alignment, the reads must be reverse-complemented again (V-CDR3-J) for the alignment to perform correctly. Reverse complement can be performed with Biostrings::reverseComplement() function.

+
# Load reference sequences (Class: DNAStringSet)
+v_segments <- readRDS("v_segments.rds")
+j_segments <- readRDS("j_segments_phe.rds")
+  
+# Load sample (Class: QualityScaledDNAStringSet)
+examples <- readRDS("example_reads.rds")
+
# Run alignment
+start_time <- Sys.time()
+
+vj_alg <- vj_alignment(reads = examples, 
+                       Vsegments = v_segments, 
+                       Jsegments = j_segments,
+                       numCores = detectCores() - 4) ### Alignment parallelization (alignment of 1 read vs all reference sequences per thread)
+
+end_time <- Sys.time()
+
# Show results
+DT::datatable(vj_alg,
+              class = 'nowrap compact order-column',
+              extensions = c('Buttons',  'FixedColumns'),
+              options = list(dom = 'Bfrtip',
+                             buttons = c('csv', 'excel'),
+                             scrollX = TRUE,
+                             fixedColumns = TRUE))
+
+ +
end_time - start_time
+
## Time difference of 2.013929 secs
+
+
+
+

2 Alignment visualization

+
+

2.1 vj_align_vis function

+
vj_align_vis <- function(alignmentOutput, readsDSS, vseg = v_segments, jseg = j_segments, whichSegment, gapOpening = 1, seqLogo = FALSE, widgHeight = 100){
+  row <- alignmentOutput
+  segment <- paste0(whichSegment, "_match")
+  
+  read <- readsDSS[row[1, "read_ID"]]
+  match <- row[1, segment]
+  HVR_start <- row[1, "HVR_start"]
+  
+  if (whichSegment == "V") {
+    best <- vseg[match]
+  } else {
+    best <- jseg[match]
+    read <- subseq(read, start = HVR_start + 3)
+  }
+  
+  alg <- pairwiseAlignment(pattern = best,
+                                 subject = read,
+                                 type = "global-local",
+                                 scoreOnly = FALSE,
+                                 gapOpening = gapOpening)
+  
+  seq <- DNAStringSet(c(alignedSubject(alg), alignedPattern(alg)))
+  
+  widget <- msaR(msa = seq,
+              overviewbox = FALSE,
+              seqlogo = seqLogo,
+              alignmentHeight = 100,
+              height = widgHeight)
+  
+  return(widget)
+}
+
+
+

2.2 Visualize alignments

+

To easily see sequence conservation enable sequence logo (Vis.elements > Show sequence logo).

+
rownum <- 1 # Row of the vj_alg dataframe to visualize
+

V alignment

+
vj_align_vis(alignmentOutput = vj_alg[rownum,],  
+             readsDSS = examples,
+             whichSegment = "V")
+
+ +

J alignment

+
vj_align_vis(alignmentOutput = vj_alg[rownum,],  
+             readsDSS = examples,
+             whichSegment = "J")
+
+ +
+
+
+
+

3 Session info

+
sessionInfo()
+
## R version 3.6.1 (2019-07-05)
+## Platform: x86_64-pc-linux-gnu (64-bit)
+## Running under: Ubuntu 18.04.2 LTS
+## 
+## Matrix products: default
+## BLAS:   /usr/lib/x86_64-linux-gnu/openblas/libblas.so.3
+## LAPACK: /usr/lib/x86_64-linux-gnu/libopenblasp-r0.2.20.so
+## 
+## locale:
+##  [1] LC_CTYPE=en_US.UTF-8       LC_NUMERIC=C              
+##  [3] LC_TIME=en_US.UTF-8        LC_COLLATE=en_US.UTF-8    
+##  [5] LC_MONETARY=en_US.UTF-8    LC_MESSAGES=en_US.UTF-8   
+##  [7] LC_PAPER=en_US.UTF-8       LC_NAME=C                 
+##  [9] LC_ADDRESS=C               LC_TELEPHONE=C            
+## [11] LC_MEASUREMENT=en_US.UTF-8 LC_IDENTIFICATION=C       
+## 
+## attached base packages:
+## [1] stats4    parallel  stats     graphics  grDevices utils     datasets 
+## [8] methods   base     
+## 
+## other attached packages:
+## [1] dplyr_1.0.2         stringr_1.4.0       msa_1.16.0         
+## [4] msaR_0.3.0          Biostrings_2.52.0   XVector_0.24.0     
+## [7] IRanges_2.18.3      S4Vectors_0.22.1    BiocGenerics_0.30.0
+## 
+## loaded via a namespace (and not attached):
+##  [1] Rcpp_1.0.5        compiler_3.6.1    pillar_1.4.6      tools_3.6.1      
+##  [5] zlibbioc_1.30.0   digest_0.6.27     jsonlite_1.7.1    evaluate_0.14    
+##  [9] lifecycle_0.2.0   tibble_3.0.4      nlme_3.1-140      lattice_0.20-38  
+## [13] pkgconfig_2.0.3   rlang_0.4.8       crosstalk_1.1.0.1 yaml_2.2.1       
+## [17] xfun_0.19         knitr_1.30        generics_0.1.0    vctrs_0.3.4      
+## [21] htmlwidgets_1.5.2 grid_3.6.1        DT_0.16           tidyselect_1.1.0 
+## [25] glue_1.4.2        R6_2.5.0          rmarkdown_2.5     purrr_0.3.4      
+## [29] magrittr_1.5      htmltools_0.5.0   ellipsis_0.3.1    ape_5.4-1        
+## [33] stringi_1.5.3     crayon_1.3.4
+
+ + + +
+
+ +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + diff --git a/docs/bibliography.bib b/docs/bibliography.bib new file mode 100644 index 0000000..762b6d0 --- /dev/null +++ b/docs/bibliography.bib @@ -0,0 +1,16 @@ +@article{10.1093/molbev/msy224, + author = {Flagel, Lex and Brandvain, Yaniv and Schrider, Daniel R}, + title = "{The Unreasonable Effectiveness of Convolutional Neural Networks in Population Genetic Inference}", + journal = {Molecular Biology and Evolution}, + volume = {36}, + number = {2}, + pages = {220-238}, + year = {2018}, + month = {12}, + abstract = "{Population-scale genomic data sets have given researchers incredible amounts of information from which to infer evolutionary histories. Concomitant with this flood of data, theoretical and methodological advances have sought to extract information from genomic sequences to infer demographic events such as population size changes and gene flow among closely related populations/species, construct recombination maps, and uncover loci underlying recent adaptation. To date, most methods make use of only one or a few summaries of the input sequences and therefore ignore potentially useful information encoded in the data. The most sophisticated of these approaches involve likelihood calculations, which require theoretical advances for each new problem, and often focus on a single aspect of the data (e.g., only allele frequency information) in the interest of mathematical and computational tractability. Directly interrogating the entirety of the input sequence data in a likelihood-free manner would thus offer a fruitful alternative. Here, we accomplish this by representing DNA sequence alignments as images and using a class of deep learning methods called convolutional neural networks (CNNs) to make population genetic inferences from these images. We apply CNNs to a number of evolutionary questions and find that they frequently match or exceed the accuracy of current methods. Importantly, we show that CNNs perform accurate evolutionary model selection and parameter estimation, even on problems that have not received detailed theoretical treatments. Thus, when applied to population genetic alignments, CNNs are capable of outperforming expert-derived statistical methods and offer a new path forward in cases where no likelihood approach exists.}", + issn = {0737-4038}, + doi = {10.1093/molbev/msy224}, + url = {https://doi.org/10.1093/molbev/msy224}, + eprint = {https://academic.oup.com/mbe/article-pdf/36/2/220/27736968/msy224.pdf}, +} +